Electroforesis en Gel

La electroforesis en gel separa fragmentos de DNA por tamaño: los más pequeños viajan más lejos hacia el polo positivo y los grandes se quedan cerca del pozo. Es la técnica de verificación de casi todo el laboratorio después de cada extracción, digestión o PCR, un gel responde la pregunta “¿obtuve lo que buscaba?”.

Un poco de historia

La electroforesis como fenómeno se conocía desde el siglo XIX, pero como herramienta para el DNA esperó hasta 1972, cuando Aaij y Borst demostraron que los geles de agarosa resuelven fragmentos de restricción. Antes de eso, el análisis de DNA era casi ciego: la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa separaba por tamaño, pero sin resolución ni comparación directa entre muestras. El salto conceptual vino de la observación de que la migración era logarítmica con el tamaño (trabajos de Southern y de Helling a fines de los 70): con esa regla, un solo carril de marcador convertía el gel en una regla medible. La electroforesis dejó de ser una curiosidad y se volvió el instrumento de medición universal de la biología molecular, el Southern (1975) y toda la genómica posterior se construyen sobre ella.

El principio: Carga uniforme, Tamizado por tamaño

El esqueleto del DNA es una cadena de fosfatos: cada nucleótido aporta una carga negativa. Eso hace que la relación carga/masa sea idéntica para cualquier fragmento, sin importar su secuencia, a diferencia de las proteínas, el DNA no necesita SDS para migrar según su tamaño. En el campo eléctrico, todos los fragmentos sienten la misma fuerza hacia el ánodo; lo que los separa es la matriz: el gel es una malla que frena proporcionalmente al tamaño del fragmento. Los fragmentos pequeños serpentean por los poros con facilidad y corren lejos; los grandes apenas caben y se rezagan.

La agarosa (malla gruesa, 0.5–2%) resuelve fragmentos de ~50 pb a ~30,000 pb. Para fragmentos menores (resolución al nivel de un solo nucleótido, como en secuenciación o RFLP pequeños) se usa poliacrilamida, cuya malla es mucho más fina.

Qué controla la resolución: el porcentaje del gel

El porcentaje de agarosa fija el tamaño de poro, y con él la ventana de resolución:

Regla práctica: elige el % cuyo rango contenga al fragmento de interés en su zona media — un genoma completo se corre en 0.5%, los productos de PCR en 1.5%, los fragmentos de restricción del 16S en 2%.

TAE vs. TBE

Ambos reguladores mantienen el pH (el DNA desprotonado migra estable) y proveen iones para conducir la corriente. Las diferencias prácticas:

• TAE (Tris-acetato-EDTA): Mayor capacidad para fragmentos grandes y corridas largas, pero se agota antes (baja capacidad buffer) y se recalienta en corridas largas.
• TBE (Tris-borato-EDTA): Mejor resolución para fragmentos pequeños, mayor capacidad buffer, geles más firmes. Es el estándar del laboratorio (todos los protocolos de esta sección corren en TBE 0.5X).
• Detalle fino: El borato puede interferir con algunas enzimas, si vas a extraer DNA del gel para ligar, considera TAE.

Los intercalantes: Hacer visible el DNA

El DNA no es visible a simple vista. Los intercalantes son moléculas planas que se deslizan entre pares de bases; al absorber luz UV emiten fluorescencia. El clásico es el bromuro de etidio (EtBr): se añade al gel o se usa como tinción posterior (5 µL de 10 mg/mL en 100 mL de TBE 0.5X, 15–20 min). Alternativas modernas como SYBR Safe son menos peligrosas y más sensibles.

El regulador de carga: densidad y dos relojes

La muestra se mezcla con regulador de carga antes de cargar: glicerol (60%) que la densifica para que se hunda en el pozo, más colorantes que hacen de relojes de migración:

• Azul de bromofenol: Corre rápido en TAE 1% equivale a ~370 pb.
• Xileno cianol: Corre lento ~4,160 pb en las mismas condiciones.

Cuando el bromofenol llega a 1 cm del borde, la corrida terminó. Los dos colorantes enmarcan la ventana útil: si tu fragmento corre entre ellos, es visible.

Leer un gel

1. Visual (Menos Exacto): Comparar la banda contra el marcador de tamaño molecular cargado en el primer carril.
2. Gráfico (Mayor Exactitud): Medir la distancia de migración de cada banda del marcador, graficar log(tamaño) contra distancia, e interpolar las bandas problema sobre la recta.

Además del tamaño, el gel informa conformación: un plásmido superenrollado corre más rápido que el linealizado, y el nicked (con una cadena cortada) más lento. Por eso el mismo miniprep puede mostrar 2–3 bandas y no son impurezas, son conformaciones.

Errores clásicos y cómo se ven en el gel

El gel no solo informa tamaño, diagnostica el experimento:

• Sonrisa (smiling): Las bandas curvan hacia arriba en los bordes corrida a voltaje demasiado alto: el gel se calienta de forma desigual y las muestras de los bordes corren más lento. Baja los voltios.
• Bandas difusas (smear): DNA degradado (nucleasas), demasiado molde cargado, o el gel se dejó polimerizar mal. Si el smear es generalizado y el marcador también se ve mal, sospecha del regulador o del gel; si solo una muestra, de esa muestra.
• Bandas que se corren juntas: se cargó demasiado volumen o el peine se retiró rompiendo los pozos.
• Nada visible, pero el marcador sí: Problema de la muestra (lisis fallida, DNA quedado en la fase orgánica) y no del gel.
• El colorante corre y no hay nada en absoluto: Revisa la orientación de los electrodos, el DNA migra hacia el ánodo (rojo); si lo conectaste al revés, corrió hacia afuera del gel.

Puntos clave

• La carga/masa uniforme hace que el tamaño sea lo único que separa. No hay que “preparar” el DNA como a las proteínas.
• El % del gel elige la ventana de resolución; el logaritmo define cuánto.
• TBE 0.5X es el caballo de batalla; TAE para fragmentos gigantes o extracción de gel.
• El EtBr intercala y fluoresce y por el mismo mecanismo es mutagénico.
• Los colorantes del regulador de carga son relojes calibrados, no decoración.

Verifícalo con los protocolos: DNA bacteriano total, miniprep y restricción enzimática terminan todos en gel.