Restricción Enzimática del DNA Total y Plasmídico
Digestión con enzimas tipo II en 20 µL de reacción, y análisis de fragmentos por electroforesis con curva semilogarítmica.
Material biológico
- DNA plasmídico y DNA recombinante (pCRII ± inserto)
- DNA del fago X
- DNA total de M. smegmatis, E. coli y S. aureus
- EcoRI, BamHI, HindIII y EcoRV (10 U/µL)
La digestión linealiza el vector y libera los fragmentos de restricción que después se ligarán o analizarán. El patrón de bandas corrobora qué fragmentos se generaron y, en el caso del DNA recombinante, permite determinar la orientación del inserto comparando los tamaños de los fragmentos.
Mezclas de digestión (20 µL finales)
Se prepara la reacción con un volumen final de 20 µL:
| Componente | E. coli |
|---|---|
| DNA | 2 µL |
| Regulador de restricción 10X | 2 µL |
| EcoRI (10 U/µL) | — |
| BamHI (10 U/µL) | — |
| HindIII (10 U/µL) | — |
| EcoRV (10 U/µL) | 1 µL |
| Agua destilada estéril | a 20 |
Metodología
Usar punta nueva y estéril para cada solución. Evita contaminar los stocks.
- Preparar las mezclas según la tabla, en microtubos etiquetados.
- Mezclar dando ligeros golpes a las paredes del tubo y centrifugar 1–5 s a 14,000 rpm para recolectar el contenido en el fondo.
- Incubar en baño metabólico a 37 °C durante 1 hora (temperatura óptima de las enzimas tipo II clásicas).
- Añadir 2 µL de regulador de carga a cada tubo, mezclar y cargar el gel.
Electroforesis y análisis
Gel de agarosa 1.2% en TBE 0.5X (0.42 g en 35 mL), marcador de tamaño molecular en el primer carril, corrida a 80–100 V durante 40–60 min, tinción con bromuro de etidio (5 µL en 100 mL de TBE 0.5X, 15–20 min) y enjuague 15–20 min.
Para cuantificar los fragmentos del fago X:
- Medir la distancia de migración (cm) de cada banda del marcador.
- Graficar el logaritmo del tamaño molecular (pb) contra la distancia de migración.
- Interpolar las distancias de los fragmentos problema sobre la recta para determinar sus tamaños.
Función de cada componente
Regulador 10X
Buffer optimizado para la enzima: pH, Mg²⁺ y sales en la proporción exacta. Usar el del fabricante de la enzima.
Desbalance: Menos de 1X → actividad estrella (corte inespecífico). Mucho más → también inhibe.
Enzimas (10 U/µL)
Endonucleasas tipo II que cortan sus sitios palindrómicos. Exceso de enzima con poco DNA también favorece actividad estrella.
Glicerol (implícito en el stock de enzima)
Estabiliza la enzima a −20 °C. Si supera el 5% de la reacción final provoca actividad estrella; por eso la enzima nunca supera 1/10 del volumen.
Regulador de carga
Glicerol 60% + azul de bromofenol: densifica la muestra para que se hunda en el pozo y colorea la migración frontal.