Obtención del DNA Plasmídico de E. coli

Procedimiento para la preparación a pequeña escala (“miniprep”) de DNA plasmídico. Para mayor cantidad de plásmido, ajustar los volúmenes proporcionalmente. Se puede trabajar con dos métodos: Lisis Alcalina Tradicional y Columna de Intercambio Iónico.

Cultivo previo

Sembrar la cepa que contiene el plásmido por estría cruzada en agar LB con el antibiótico de selección. Tomar una colonia aislada e inocular 3 mL de medio líquido con antibiótico; incubar a 37 °C y 200 rpm durante 12 h.

Método I: Lisis Alcalina Tradicional

1. Transferir 1.5 mL del cultivo a microtubos. Centrifugar a velocidad máxima (14,000 rpm ≈ 13,877 × g) durante 5 min. Adicionar el remanente del cultivo, centrifugar de nuevo y eliminar totalmente el sobrenadante.
2. Resuspender el paquete celular en 100 µL de solución GTE (glucosa 50 mM, Tris 25 mM pH 8.0, EDTA 10 mM). Verificar resuspensión total y colocar en hielo.
3. Adicionar 200 µL de solución de lisis alcalina (NaOH 0.2 M, SDS 1%), mezclar por inversión 5 veces y reposar 5 min en hielo.
4. Añadir 150 µL de solución de neutralización (acetato de potasio), mezclar por inversión 5 veces y reposar 5 min en hielo.
5. Centrifugar 5 min a velocidad máxima.
6. Transferir 400 µL del sobrenadante a un tubo nuevo, evitando el material blanquecino pegado a las paredes: contiene el DNA genómico bacteriano.
7. (Opcional) Añadir 3 µL de RNasa (10 mg/mL) e incubar a 37 °C durante 30 min.
8. Adicionar 400 µL de fenol saturado/cloroformo (1:1), centrifugar 2 min a velocidad máxima y pasar la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo.
9. Adicionar 1.5 volúmenes de etanol al 95% (o 1 volumen de isopropanol), mezclar por inversión y reposar 10 min en hielo. Mejora la precipitación un baño de hielo seco con etanol.
10. Centrifugar 10 min a velocidad máxima: se forma la pastilla blanca de DNA plasmídico pegada a la pared. Eliminar el alcohol por inversión.
11. Lavar con 1 mL de etanol al 70%, centrifugar de nuevo y eliminar todo el etanol con micropipeta sin desprender la pastilla. Secar por evaporación o en SpeedVac.
12. Resuspender en 30 µL de agua destilada estéril o TE 1X.
13. Etiquetar para caracterización por espectrofotometría UV y electroforesis.

Método II: Columna de Intercambio Iónico

1. Centrifugar 3 mL del cultivo a velocidad máxima, 5 min; descartar sobrenadante.
2. Resuspender en 250 µL de solución de resuspensión (con ayuda de vórtex).
3. Añadir 250 µL de solución de lisis alcalina; mezclar por inversión 4 veces.
4. Añadir 10 µL de proteasa alcalina; mezclar por inversión 4 veces e incubar 10 min a temperatura ambiente.
5. Añadir 350 µL de solución de neutralización; mezclar por inversión 4 veces.
6. Centrifugar a velocidad máxima durante 10 min.
7. Insertar la columna en el tubo colector y cargar el sobrenadante.
8. Centrifugar 1 min a velocidad máxima; desechar el eluato.
9. Lavar con 750 µL de solución de lavado; centrifugar 1 min y desechar el eluato.
10. Añadir 250 µL de lavado; centrifugar 2 min, desechar eluato y centrifugar otra vez 1 min para secar la resina.
11. Transferir la columna a un microtubo limpio.
12. Eluir con 50 µL de agua libre de nucleasas en el centro de la resina; reposar 2 min a temperatura ambiente y centrifugar 1 min.
13. Desechar la columna y conservar el plásmido a −20 °C.

Electroforesis de verificación

Gel de agarosa 1.2% en TBE 0.5X (0.42 g en 35 mL), marcador de tamaño molecular, corrida a 80–100 V durante 40–60 min, tinción con bromuro de etidio (5 µL en 100 mL de TBE 0.5X, 15–20 min) y enjuague 15–20 min. Cuantificar el DNA y conservar a −80 °C.

Función de cada reactivo

Verifica tus bandas en el simulador de electroforesis: el plásmido corre como superenrollado, linealizado o en nicks según su conformación.