Obtención del DNA Bacteriano Total

Todos los métodos de extracción de DNA comparten cuatro pasos fundamentales: lisis celular (mecánica, química o enzimática), desnaturalización de las proteínas asociadas al DNA con solventes orgánicos, separación del DNA por precipitación con etanol/isopropanol o cromatografía de intercambio iónico, y purificación final. La metodología depende del material biológico, del tipo de DNA requerido y del nivel de integridad necesario: secuenciación, Southern o electroforesis de campos pulsados exigen DNA de alta calidad e integridad para resultados reproducibles.

Material biológico

Cepas bacterianas en cultivo de 5 mL en fase estacionaria: Escherichia coli, E. coli + pCRII, Staphylococcus aureus y Mycobacterium smegmatis.

Metodología

Usar punta nueva para cada solución.

1. A partir de un cultivo en fase estacionaria de la cepa indicada, tomar 5 mL. Centrifugar y desechar el sobrenadante.
2. Resuspender las bacterias en 400 µL de TE 1X (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0).
3. Calentar a 80 °C durante 20 min; dejar enfriar a temperatura ambiente.
4. Adicionar 50 µL de lisozima (10 mg/mL) y agitar en vórtex.
5. Incubar a 37 °C de 40 a 60 min.
6. Adicionar 75 µL de la mezcla proteinasa K/SDS (5 µL de proteinasa K 20 mg/mL + 70 µL de SDS 10%), agitar suavemente en vórtex e incubar a 65 °C durante 10 min.
7. Adicionar 100 µL de NaCl 5 M y 100 µL de CTAB precalentado a 65 °C; agitar en vórtex hasta aspecto “lechoso” e incubar a 65 °C durante 10 min.
8. Adicionar 750 µL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), agitar en vórtex y centrifugar a temperatura ambiente a 12,000 × g durante 5 min.
9. Transferir la fase acuosa a un microtubo nuevo, adicionar 0.6 volúmenes de isopropanol frío y precipitar a −20 °C durante 20 min (es preferible toda la noche).
10. Centrifugar a temperatura ambiente a 12,000 × g durante 5 min, eliminar el sobrenadante, adicionar 1 mL de etanol frío al 70%, mezclar por inversión y centrifugar nuevamente.
11. Descartar el sobrenadante y secar el botón de DNA en SpeedVac (secado al vacío).
12. Resuspender en un volumen apropiado de agua libre de nucleasas.
13. Cuantificar el DNA por espectrofotometría.

Electroforesis de verificación

Gel de agarosa 1% en TBE 0.5X (0.35 g de agarosa en 35 mL de TBE 0.5X, disolver en microondas sin sobrecalentar), marcador 1 kb y λ-HindIII en el primer carril.

1. Vaciar la agarosa a 50 °C en la cámara nivelada, peine a 1 cm del extremo; dejar polimerizar ~30 min y retirar el peine con cuidado.
2. Pozos hacia el cátodo (negro); cubrir con TBE 0.5X hasta 1 cm sobre el gel.
3. Cargar 10 µL de marcador y las muestras mezcladas con regulador de carga (punta diferente por muestra).
4. Correr a 80–100 V durante 40–60 min, hasta que el colorante llegue a 1 cm del extremo. Apagar la fuente antes de desconectar.
5. Tinción: 100 mL de TBE 0.5X + 5 µL de bromuro de etidio (10 mg/mL), 15–20 min; enjuagar en agua destilada 15–20 min; visualizar en el fotodocumentador.
6. Conservar el DNA a −80 °C para usos posteriores.

Función de cada reactivo

Puedes simular cómo se verían los fragmentos en el simulador de electroforesis y calcular la concentración obtenida con la fórmula A260 (1 unidad = 50 µg/mL de DNA doble hélice).