PCR y sus Variantes

La PCR (Kary Banks Mullis, 1983) es una reacción cíclica enzimática que sintetiza DNA in vitro. Se apoya en una sola propiedad: a temperatura alta el DNA se desnaturaliza y a temperatura baja se renaturaliza. Sirve desde pruebas de paternidad hasta diagnóstico de enfermedades (como la anemia falciforme) e identificación de microorganismos que no se pueden cultivar.

Los tres pasos

1. Desnaturalización (94 °C): Las cadenas se separan.
2. Alineamiento (50–60 °C, según los iniciadores): Los primers forman híbridos con sus secuencias complementarias.
3. Extensión (72 °C con Taq): La polimerasa sintetiza desde los iniciadores.

Cada ciclo duplica el molde, pero los fragmentos exponenciales exactos aparecen a partir del tercer ciclo: en los dos primeros se sintetizan productos de longitud variable; desde el tercero, los productos que empiezan y terminan en los dos primers dominan la reacción.

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Factores críticos

La Enzima

Cuatro propiedades la definen: Procesividad (cuántas bp copia antes de despegarse), Frecuencia de errores (sustituciones por base), Sensibilidad (amplificar pocas copias) y Especificidad (amplificar solo el fragmento de interés). La Taq clásica gana termoestabilidad pero pierde fidelidad; para secuenciación o clonación expresiva existen polimerasas con actividad correctora.

Los Iniciadores

• 18–24 bp para asegurar unión única. La probabilidad de que un iniciador se una en otro sitio del genoma es aproximadamente $\frac{\text{tamaño\_genómico}}{4^{\text{bp del iniciador}}}$ — por eso 20 bp bastan: 4²⁰ supera al genoma humano.
• GC entre 35–65%. Si el blanco es muy rico en GC, añadir colas AT en 5’ baja la Tm.
• Evitar complementariedad entre primers, especialmente en el extremo 3’: si se unen entre sí, se autoconsumen (primer-dimers).
• Ta = Tm − 2 °C (regla rápida; la calculadora de Tm/Ta lo hace con el modelo de vecinos más cercanos). Ta baja → unión inespecífica; Ta alta → no se unen.
• Extensión: 1 min por cada 1,000 bp, con margen (1,500 bp → 2 min).

El Magnesio (Mg)

El Mg²⁺ forma el complejo Mg-dNTP que la Taq incorpora, y debe exceder la concentración total de grupos fosfato (dNTPs + molde + primers). Es el factor al que la PCR es más sensible.

Mapa de modalidades

Todas las variantes reutilizan los mismos tres pasos, cambiando qué se amplifica o cómo se detecta:

• PCR múltiple: Varios genes en la misma reacción (hasta 7); todos los primers comparten la misma Ta.
• PCR anidada: Aumenta la sensibilidad cuando hay baja carga bacteriana (e.g. LCR): Primera PCR con Ta #1, luego una segunda PCR sobre el amplicón con primers internos (anidados) y Ta #2.
• RFLP-PCR: PCR → digestión del amplicón → perfil electroforético. Se usa en micobacterias no tuberculosas y Aeromonas; el protocolo completo en PCR-RFLP.
• PCR inversa: Digiere → liga → amplifica → BLAST para localizar dónde se insertó un gen.
• RAPD: Un solo primer de 10 bp, sin conocer la secuencia: amplifica fragmentos menores a 3,000 bp donde el primer encuentra sitios; el patrón es una huella genética.
• RT-PCR: RNA → DNA-RNA → RNasa H → DNA pol → cDNA: convierte el transcriptoma en amplificable.
• RT-qPCR: RT-PCR con detección en tiempo real (fluorescencia por ciclo): cuantifica.
• Digital PCR: Particiona la muestra en miles de microreacciones y cuenta cuáles encendieron: cuantificación absoluta sin curvas de calibración.

Más modalidades que conviene reconocer

• Touchdown PCR: La Ta arranca varios grados por encima del óptimo y baja gradualmente ciclo a ciclo. Al inicio solo se une el par más específico (la unión perfecta); cuando la Ta alcanza el óptimo, el producto ya domina la reacción. Es la cura empírica para la inespecificidad: en vez de optimizar la Ta, la haces decrecer.
• Hot-start PCR: La Taq queda inactiva hasta el primer desnaturalizamiento (anticuerpo bloqueante, o simplemente no añadir la Taq hasta que el tubo esté a 94 °C en la versión manual). Elimina el producto inespecífico que se forma antes del primer ciclo, cuando todo está frío y los primers se unen donde pueden.
• Colony PCR: El molde es una colonia completa picada con la punta directamente en la mezcla: en unas horas sabes si la clona lleva el inserto, antes de hacer miniprep. El calor del primer ciclo lisa las células y libera el plásmido.
• PCR alelo-específica (ARMS): El primer lleva su extremo 3’ sobre el polimorfismo: si la base no coincide, la Taq no extiende. Solo amplifica el alelo que coincide. Se utiliza en diagnóstico de genotipos en un gel.
• PCR in situ: Se amplifica dentro de células o cortes fijados en el portaobjetos: localiza la diana en la histología, no en un tubo.
• PCR emulsión: Cada molécula se encapsula en una gotita de agua en aceite con sus propios reactivos: miles de PCRs independientes en un tubo. Es el principio de la amplificación en beads de la 2ª generación de secuenciadores.

Puntos clave

• La exponencialidad empieza en el ciclo 3. Antes, la reacción “no rinde” porque aún no genera productos definidos.
• El Mg²⁺ es el tornillo de ajuste fino: mueve rendimiento y especificidad en direcciones opuestas.
• Cada modalidad resuelve un problema distinto: sensibilidad (anidada), multiplexado (múltiple), identificación (RFLP-PCR), cuantificación (qPCR/digital).
• Ta = Tm − 2 es el punto de partida, no el veredicto: se optimiza empíricamente.