Identificación de Bacterias Patógenas por PCR-RFLP
Amplificación del rRNA 16S, purificación del producto y digestión con HaeIII para generar patrones de bandas especie-específicos.
Material biológico
- Producto de PCR del rRNA 16S de E. coli, S. aureus, M. smegmatis y M. mucogenicum
- Enzima HaeIII con su regulador
- Kit de purificación de productos de PCR (Qiagen: QG, PE, EB)
La PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) combina dos técnicas: se amplifica un gen conservado como el rRNA 16S (~1500 pb) y se digestiona con una enzima de restricción. Como las mutaciones que crean o destruyen sitios de corte difieren entre especies, cada bacteria produce un patrón de bandas característico que permite identificarla sin secuenciar.
I. Amplificación del gen rRNA 16S
Molde: DNA genómico de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis o M. mucogenicum. Mezclas de 25 µL:
| Reactivo (µL) | Tubo problema |
|---|---|
| Agua | 19.15 |
| Regulador 10X | 2.5 |
| MgCl₂ 50 mM | 0.75 |
| dNTPs 5 mM | 0.5 |
| Iniciadores universales 20 µM | 1.0 |
| Taq polimerasa 5 U/µL | 0.1 |
| DNA | 1.0 |
Programa de ciclado:
| Ciclos | Temperatura | Tiempo |
|---|---|---|
| 1 | 94 °C | 5 min |
| 45 | 94 °C / 52 °C / 72 °C | 1 min / 1 min / 2 min |
| 1 | 72 °C | 10 min |
Mantener las mezclas a 4 °C hasta el ciclado; agitar y dar un pulso en la microcentrífuga.
II. Purificación del producto de PCR (columna)
- Correr el producto en agarosa 1.5% en TBE 0.5X (5 µL de muestra + 5 µL de regulador de carga, 90 V, 45–60 min) y teñir con bromuro de etidio (5 µL en 100 mL).
- Con bisturí estéril, cortar el fragmento de gel que contiene el DNA amplificado y colocarlo en un microtubo.
- Pesar el gel y añadir 3 volúmenes del regulador QG por cada unidad de peso (100 mg de gel → 300 µL de QG).
- Incubar a 50 °C en baño metabólico hasta disolver el gel por completo.
- Añadir 1 volumen de isopropanol y mezclar por inversión.
- Cargar en la columna y centrifugar a velocidad máxima 1 min; desechar el eluato.
- Lavar con 750 µL del regulador PE y centrifugar de nuevo.
- Centrifugar una vez más para eliminar el exceso de regulador.
- Eluir en un tubo limpio con 30 µL del regulador EB (o agua estéril), reposar 30 s y centrifugar 30 s a velocidad máxima.
III. Digestión con HaeIII
Mezclas de 15 µL:
| Reactivo (µL) | Tubo problema | Control (−) |
|---|---|---|
| Agua | 2.5 | 10.5 |
| Regulador 10X | 1.5 | 1.5 |
| Producto amplificado | 10.0 | 3.0 |
| HaeIII | 1.0 | 0.0 |
- Usar punta nueva y estéril para cada solución.
- Mezclar con un pulso de microcentrífuga.
- Incubar a 37 °C durante 1 hora.
- Añadir 2 µL de regulador de carga y correr el volumen total en agarosa 2% en TBE 0.5X, a 90 V durante 50 min.
- Teñir con bromuro de etidio (5 µL en 100 mL de TBE 0.5X) y fotografiar.
Interpretación
Registra el número y tamaño de las bandas de cada especie: el patrón RFLP es la huella digital de cada bacteria. Compara los patrones entre especies.
Función de cada reactivo
HaeIII
Endonucleasa tipo II que corta en GGCC (extremos romos). Sus sitios en el 16S difieren entre especies, generando los patrones polimórficos.
Regulador QG
Solución de solubilización del gel: funde la agarosa a 50 °C y provee la sal alta que adsorbe el DNA a la columna de sílice.
Regulador PE (lavado)
Lava sales y agarosa residual de la columna; traza de etanol residual se elimina con la centrifugación en seco.
Iniciadores universales del 16S
Anillan regiones ultraconservadas del gen, permitiendo amplificar el 16S de cualquier bacteria; el polimorfismo queda en el interior de la secuencia.