Obtención del RNA Bacteriano Total

El RNA es la macromolécula más frágil del laboratorio: Las RNasas son ubicuas, muy estables y no requieren cofactores. Por eso este protocolo se juega entero en la cadena fría y en reactivos libres de nucleasas. La solución de lisis se prepara al momento.

Antes de empezar

1. Preparar la solución de lisis fresca y mezclar en vórtex:
   • Agua tratada con DEPC: 910 µL
   • SDS al 10%: 50 µL
   • Acetato de sodio 1 M: 20 µL
   • EDTA 0.5 M: 20 µL
2. Colocar 500 µL de fenol-ácido en microtubos de 2.0 mL y calentar en thermoblock a 65 °C durante 5 min.

I. Extracción

A partir de 5 mL de cultivo en fase logarítmica de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus o Mycobacterium smegmatis:

1. Cosechar las células centrifugando a 8,000 × g durante 20 min a 4 °C; desechar el sobrenadante.
2. Resuspender el paquete celular en 500 µL de la solución de lisis, mezclar en vórtex hasta resuspensión total y colocar en hielo.
3. Lisar con tres ciclos consecutivos: vórtex a máxima velocidad 30 s → hielo 30 s.
4. Añadir los 500 µL de fenol-ácido precalentado y mezclar 30 s en vórtex, verificando que se mezcle por completo.
5. Incubar a 65 °C durante 5 min en thermoblock.
6. Agitar en vórtex 30 s.
7. Centrifugar a 13,000 × g durante 5 min a 4 °C y transferir cuidadosamente la fase acuosa a un tubo limpio.
8. Añadir 1 mL de etanol absoluto frío, mezclar suavemente e incubar a −70 °C durante 30 min (es recomendable toda la noche).
9. Centrifugar a 13,000 × g durante 10 min a 4 °C; desechar el sobrenadante y añadir 500 µL de etanol al 70%; mezclar con la punta de la pipeta o unos segundos en vórtex.
10. Centrifugar a 13,000 × g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y eliminar el exceso de etanol en el SpeedVac a temperatura baja.
11. Resuspender en 50 µL de agua tratada con DEPC estéril, con golpeteos suaves del dedo, nunca vórtex y mantener en hielo.

II. Tratamiento con DNasa

El RNA total arrastra DNA contaminante; se elimina enzimáticamente:

1. Añadir 5 µL del regulador de la DNasa turbo y 1 µL de DNasa turbo.
2. Mezclar suavemente (golpeteos) e incubar a 37 °C durante 30 min.
3. Añadir 5 µL del reactivo de inactivación, mezclar e incubar 5 min a temperatura ambiente.
4. Centrifugar a 13,000 × g durante 5 min a 4 °C y transferir la fase acuosa a un microtubo limpio.
5. Guardar el RNA en el ultracongelador.

III. Electroforesis Desnaturalizante (Gel de Cloro)

La integridad del RNA se verifica en condiciones que eliminan la estructura secundaria. Gel de agarosa 1% en TBE 0.5X adicionado con 350 µL de Clorox por 35 mL de gel (condiciones desnaturalizantes):

1. Disolver 0.35 g de agarosa en 35 mL de TBE 0.5X + Clorox, en microondas sin sobrecalentar; verter a 50 °C y polimerizar ~30 min.
2. Correr las muestras con regulador de carga a 80–100 V durante 40–60 min.
3. Teñir con bromuro de etidio (5 µL en 100 mL de TBE 0.5X, 15–20 min), enjuagar 15–20 min y visualizar en el fotodocumentador.

Función de cada reactivo

Este RNA es el insumo natural de la síntesis de cDNA — el primer paso hacia una biblioteca de expresión (ver la ficha de Clonación molecular).