Clonación Molecular

Clonar es aislar y replicar copias idénticas de una secuencia de DNA. Se hace insertando un fragmento de DNA en una molécula circular (el vector) para crear un DNA recombinante, introducirlo en una célula huésped y dejar que la célula lo replique por nosotros. Todo el proceso persigue dos fines: estudiar la estructura y función de un fragmento, y producir cantidades grandes de su producto (RNA o proteína) con aplicación médico-biológica.

Un poco de historia

La clonación nació de dos preguntas que convergieron. En 1972, Paul Berg y colaboradores construyeron en un tubo de ensayo la primera molécula de DNA recombinante. Un año después, Cohen, Chang, Boyer y Helling hicieron el ciclo completo: cortaron dos plásmidos con la misma endonucleasa, los ligaron, transformaron E. coli y recuperaron clonas con ambos orígenes de replicación — el primer DNA recombinante replicado por una célula viva. El hallazgo desató tanto entusiasmo como preocupación: en 1975, la conferencia de Asilomar estableció voluntariamente pausas y niveles de contención para experimentos de recombinación — el primer marco de bioseguridad de la biología moderna, y el origen de las comisiones que hoy autorizan estos experimentos en todo el mundo.

Las cuatro etapas

1. Producción de la molécula de DNA recombinante — La ligasa une el fragmento al vector, ambos previamente linealizados por digestión.
2. Transformación — Introducir el DNA desnudo en una célula huésped competente.
3. Clonación propiamente dicha — La bacteria crece en medio rico y replica el recombinante dentro de sí.
4. Obtención de la clona recombinante — Selección y cribado de las colonias correctas.

Las Enzimas

Nucleasas: Las encargadas de cortar

Las exonucleasas eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (5’ o 3’); pueden atacar ambas cadenas (e.g. Bal31) o solo una (e.g. Exonucleasa III de E. coli, que produce ssDNA). Las endonucleasas cortan por dentro de la cadena: la DNasa I corta ambas cadenas pero sin especificidad; la endonucleasa S1 solo DNA de una cadena. Las endonucleasas que cortan ambas cadenas en sitios específicos son las enzimas de restricción.

El Sistema Restricción-Modificación (R-M)

Es el sistema inmune innato de las bacterias contra los fagos: la parte R degrada el DNA exógeno cuyo patrón de metilación difiere del propio; la parte M metila (con el metilo donado por la S-adenosilmetionina) las A/C de las secuencias de reconocimiento para proteger el DNA autóctono. De los 4 tipos de endonucleasas, la tipo II es la que domina el laboratorio: corta en (o muy cerca de) su sitio de reconocimiento, que es palindrómico y de 4–8 bp, con una sola subunidad.

Ligasas: Encargadas de Unir

Descubiertas por Gellert (1967), forman los enlaces fosfodiéster. La T4 DNA ligasa consume ATP para sellar el inserto en el vector.

Polimerasas y Modificadoras

La DNA pol I repara daños cortos (tiene actividad exonucleásica Y polimerásica); el Fragmento de Klenow es la pol I sin sus 323 aminoácidos N-terminales, así, eliminando la exonucleasa. La transcriptasa reversa sintetiza cDNA a partir de una plantilla de RNA. Y las modificadoras ajustan extremos: La Fosfatasa Alcalina quita el fosfato 5’ (evita que el vector se ligue consigo mismo), la Polinucleótido Cinasa lo añade, y la Transferasa Terminal encadena nucleótidos en el extremo 3’.

Los Vectores

Un vector de clonación (2–5 kb típico, multicopia, sin genes de conjugación) necesita tres cosas:

• Ori — Origen de replicación independiente del cromosoma.
• MCS — Sitio Múltiple de Clonación: Un fragmento corto dónde se encuentren los sitios de reconocimiento de muchas enzimas de restricción.
• Marcadores de Selección — Resistencia a antibióticos (e.g. AmpR, TetR) o fenotípicos como lacZα (colonias azules por β-galactosidasa).

Clásicos: pBR322 (AmpR, TetR), pUC (AmpR, lacZα), pCRII (AmpR, lacZα, promotores SP6/T7). Además de los plasmídicos existen vectores basados en bacteriófagos y vectores de expresión, estos últimos añaden promotores y señales ribosomales para que el inserto no solo se copie, sino se traduzca.

Bibliotecas: Clonar en masa

Una biblioteca genómica fragmenta el genoma completo y clona cada fragmento; una biblioteca de cDNA parte del mRNA purificado (capturado con oligo-dT), lo retrotranscribe y clona, es decir, solo contiene los genes que se estaban expresando. La diferencia es información: la genómica tiene genes completos con intrones; la de cDNA, transcritos maduros.

Transformación: Ingresar el DNA

Las células se hacen competentes con CaCl₂ Frío (alta eficiencia, barato) o por electroporación (campo eléctrico que perfora la membrana). El choque térmico (60 min en hielo → 90 s a 42 °C → hielo) induce la toma de DNA.

Selección de Recombinantes

Dos capas de Filtrado:

1. Selección con Antibiótico — Solo crecen bacterias transformadas (con el vector).
2. Selección de Recombinantes — La α-complementación de la β-galactosidasa lo hace visible: en placas con X-Gal + IPTG, colonias azules = vector sin inserto (lacZα intacto); colonias blancas = inserto interrumpió lacZα. La contraselección molecular moderna usa genes letales como ccdB con el mismo fin.

Más Allá de la Restricción-Ligación: Clonación Moderna

El Flujo Restricción → Ligación de esta ficha es el clásico, pero hoy conviven estrategias que lo evitan:

• Gibson Assembly — Fragmentos con ~20–40 pb de homología en sus extremos se unen en un solo tubo con tres enzimas: una exonucleasa que corta los extremos (creando cohesiones), la polimerasa que las rellena y la ligasa que sella. Sin enzimas de restricción, sin MCS, sin “¿qué enzima corta aquí pero no allá?”.
• Golden Gate — Usa enzimas tipo IIS (e.g. BsaI, BsmBI), que cortan fuera de su sitio de reconocimiento: el sobresaliente resultante se diseña a la medida, y varias piezas se ensamblan en orden predefinido en una sola reacción. Es el estándar de la biología sintética.
• TOPO — La topoisomerasa del Fwago T4 se une covalentemente al vector ya abierto y captura PCR products con extremos específicos: ligación instantánea, sin ATP.

Aplicaciones: Del tubo de ensayo al mercado

La Clonación dejó de ser técnica para volverse industria:

• Medicina: La insulina humana recombinante (Humulin, 1982) fue el primer fármaco de DNA recombinante aprobado. El gen humano clonado en E. coli reemplazó a la insulina extraída de páncreas porcino/bovino. Hoy la lista incluye hormona de crecimiento, factores de coagulación y vacunas de subunidades.
• Diagnóstico: Las sondas y controles que usa el laboratorio (como el pCRII de los protocolos) existen porque alguien clonó y amplificó esas secuencias.
• Biotecnología: Enzimas recombinantes (como la propia Taq que usas en PCR), enzimas industriales, y con el sistema CRISPR/Cas como herramienta de edición, la frontera actual: no solo clonar genes, sino reescribirlos (ver la ficha de CRISPR).

Puntos clave

• Tipo II corta donde reconoce; por eso es la herramienta, no las tipos I y III.
• El pH del fenol y el Na⁺→K⁺ no son los únicos trucos químicos: la fosfatasa alcalina evita la auto-ligación del vector.
• Azul/blanco es genética de un gen (LacZα) convertida en color.
• La eficiencia de ligación se mide: % recombinantes / transformantes × 100 — ver el protocolo de laboratorio.