Secuenciación

Secuenciar es determinar el orden de nucleótidos en un oligo de DNA. En 1977 nacen dos métodos: Gilbert y Maxam (degradación química) y Sanger y Coulson (síntesis de DNA), de este último parten casi todos los métodos que existen. El primer genoma secuenciado fue el del virus φX174. Un detalle conceptual: la secuencia que se lee es la molde y el resultado es su complementaria.

Sanger-Coulson: La terminación de cadena

La idea es elegante: además de dNTPs, la reacción incluye dideoxiNTPs (ddNTPs), nucleótidos sin el OH en 3’ que cuando la polimerasa los incorpora, la síntesis muere ahí mismo.

• Se trabaja en 4 tubos, cada uno con un ddNTP distinto (A, C, G, T) más todos los dNTPs y la DNA pol.
• La proporción es dNTPs ≫ ddNTP: Cada molécula incorpora un ddNTP en una posición distinta al azar, generando fragmentos de todas las longitudes posibles que terminan en esa base.
• Los fragmentos se separan en gel y se leen de abajo hacia arriba, es decir, del fragmento más corto al más largo y así poder ir reconstruyendo la secuencia complementaria.
• Alcance: Hasta ~400 bp por reacción.

Terminador Fluorescente (Sanger automatizado)

Lo mismo, con dos cambios: los ddNTPs llevan fluorocromos distintos (uno por base) y todo ocurre en un solo tubo. El equipo lee cada fluorocromo al pasar y entrega la secuencia como un espectrograma (los “picos” de cromatograma). Es el estándar de las lecturas individuales: verificar un clon, confirmar un mutante, secuenciar un PCR.

Shotgun: Secuenciar un genoma entero con Sanger

Antes de la segunda generación, secuenciar un genoma era un problema de logística: Sanger lee ~400 bp, y un genoma son millones de pares. La solución es la estrategia shotgun (“escopeta”) para disparar el problema en pedazos:

1. Fragmentar el DNA al azar (sonicación) en miles de trozos pequeños.
2. Clonar cada trozo en un vector y secuenciarlo por Sanger desde ambos extremos.
3. Ensamblar: Un algoritmo busca los solapamientos entre las miles de lecturas y las une en contigs, como armar un rompecabezas de piezas solapadas.

Hubo dos escuelas. El consorcio público del Proyecto Genoma Humano usó la variante jerárquica (BAC-to-BAC): primero un mapa ordenado de fragmentos grandes (~150 kb en cromosomas artificiales de bacterias), luego shotgun de cada BAC, lento pero ordenado, cada lectura sabe dónde vive. Celera (Venter, 2000) apostó por el whole-Genome Shotgun puro: Fragmentar todo al azar y confiar en que la cobertura masiva y la computación ensamblaran el rompecabezas sin mapa previo. La apuesta funcionó, con controversia sobre cuán bien y el debate metodológico quedó resuelto por la historia: El shotgun sin mapa es exactamente lo que hace hoy cualquier secuenciador.

Segunda generación: Secuenciar en masa

Pirosecuenciación, terminador reversible y detección de protones comparten filosofía: secuenciar millones de fragmentos a la par en lugar de uno a la vez. Todos requieren una biblioteca con tres pasos:

1. Fragmentación al azar del DNA en trozos de 100–600 bp de pureza total típicamente por sonicación: La cavitación acústica rompe las moléculas de alto peso.
2. Inmovilización de los fragmentos en un soporte sólido, unidos a un bead mediante adaptadores (e.g. streptavidina-biotina).
3. Amplificación de los fragmentos inmovilizados por PCR.

Pirosecuenciación

Nombrada por los pirofosfatos que libera la polimerización; no requiere electroforesis. Un circuito enzimático convierte cada incorporación en luz:

• Apirasa: Degrada los dNTPs que no se incorporaron (dNDP + P).
• Polimerasa: Incorpora el dNTP complementario, liberando PPi y H⁺.
• Sulfurilasa: Une el PPi al APS (adenosín-5’-fosfosulfato) para formar ATP.
• Luciferasa: Convierte luciferina en oxiluciferina gastando ese ATP y emite un fotón: El equipo cuenta destellos, un pico de luz por base.

Se abandonó por el costo operativo de mantener cuatro enzimas en cada corrida.

Illumina (terminador reversible)

El nucleótido lleva en el 3’ un grupo bloqueador: La polimerasa incorpora uno, la reacción se detiene, el equipo fotografía qué base entró, un lavado remueve el bloqueador y el ciclo se repite. Base por base, nt tras nt. Lee ~300 bp por fragmento, pero en paralelo masivo: ~2,000 Mb por corrida, es la plataforma que dominó el resecuenciado de genomas.

Ion Torrent (semiconductor)

No usa luz: detecta la liberación de H⁺ de cada incorporación. Los protones bajan el pH del micropozo, y el chip traduce ese cambio en voltaje directamente proporcional al número de nucleótidos incorporados (homopolímeros largos dan señales más grandes).

Tercera generación: Leer mientras se sintetiza

La diferencia conceptual: Todo ocurre en tiempo real, durante el progreso de la polimerasa, sin impedirla y eso permite lecturas mucho más largas.

SMRT (Single Molecule Real-Time)

Fragmentos de DNA de alto peso molecular con adaptadores, inmovilizados en un chip donde cada uno se une a una DNA pol en cámaras nanofotónicas (zero-mode waveguides). Cada dNTP lleva su fluorocromo: la cámara detecta la entrada del nucleótido en 10⁻⁶ s y la formación del enlace fosfodiéster en 10⁻³ s se identifica la base por su fluorocromo justo cuando se incorpora. Lecturas de hasta 20 kb.

Nanopore

El MinION pasa el DNA a través de nanoporos de ~1 nm en una membrana: al atravesar el poro, cada nucleótido perturba la corriente iónica de forma característica, y esa huella identifica la base en tiempo real, sin parar la enzima. Sus límites: la cadena fuera del poro también afecta el flujo de iones, y la señal depende de la velocidad a la que el DNA atraviesa el poro. A cambio, lecturas ultralargas y un equipo del tamaño de un USB.

Del laboratorio a la clínica

• Diagnóstico de enfermedades infecciosas: Secuenciar directamente una muestra clínica (metagenómica shotgun) identifica el patógeno sin cultivarlo; fue así como se identificaron agentes como el virus del Zika o los coronavirus nuevos en días en lugar de meses.
• Oncología de precisión: El perfil de mutaciones de un tumor (por NGS) decide hoy terapias dirigidas; la biopsia líquida lo repite con cfDNA en sangre.
• Diagnóstico prenatal: El DNA fetal circulante se secuencía desde una muestra de sangre materna, pudiendo detectar aneuploidías sin amniocentesis.
• Lecturas largas en la práctica: Nanopore/SMRT resuelven lo que las cortas no pueden: regiones repetidas, haplotipos completos, y modificaciones químicas de las bases leídas directamente de la molécula.

Puntos clave

• Todos los métodos de Sanger en adelante son síntesis; solo Gilbert-Maxam fue degradación y por eso perdió.
• El ddNTP es un dNTP sin el OH en 3’: La misma lógica reaparece en Illumina como bloqueador reversible.
• La biblioteca (fragmentar → inmovilizar → amplificar) es el boleto de entrada a toda segunda generación.
• Cada generación cambió la señal: Radiactividad/visual → fluorescencia → luz enzimática → pH → corriente iónica.