Proteómica

El DNA se puede amplificar, para eso existe la PCR. Las proteínas no: no hay reacción que multiplique una proteína, así que la proteómica depende de separar, transferir y detectar con lo poco que hay. Sus herramientas centrales son la electroforesis, los anticuerpos y la espectrometría de masas.

Western Blot (1979)

La técnica de detección de una proteína específica: Alta sensibilidad, cualitativa y cuantitativa. Determina Presencia o Ausencia, Peso Molecular y Expresión Relativa. La lógica es la misma que la Southern para DNA, separar en gel, transferir a membrana y detectar con una “sonda”, pero la sonda aquí es un anticuerpo.

1. Lisado celular para obtener las proteínas.
2. Desnaturalización y SDS-PAGE: SDS confiere carga negativa uniforme a todas las proteínas, el calor (90 °C) desnaturaliza, y el 2-mercaptoetanol rompe los enlaces disulfuro. Con la carga igualada, las proteínas se ordenan por peso molecular: las grandes arriba, las pequeñas abajo.
3. Transferencia a membrana: Como en la Southern, o con equipos especializados.
4. Bloqueo: Saturar los sitios inespecíficos de la membrana (leche en polvo o albúmina) para que el anticuerpo solo se una a su blanco.
5. Incubar con anticuerpo primario: Reconoce específicamente la proteína diana.
6. Incubar con anticuerpo secundario: Reconoce al primario y lleva la señal (enzima o fluorocromo).
7. Lavado: Elimina el anticuerpo que no se unió.
8. Revelado: La señal revela dónde está la diana.

Electroforesis Bidimensional

El Western detecta una proteína a la vez. Para mirar el proteoma completo se separa en dos dimensiones ortogonales:

1. Primera dimensión: punto isoeléctrico (pI): Un gradiente de pH donde cada proteína migra hasta el pH donde su carga neta es cero. Se usan un detergente no iónico (octilglucósido), β-mercaptoetanol y urea: Disuelven, desnaturalizan y disocian cadenas sin alterar la carga intrínseca, sin ellos, el pI no sería confiable.
2. Segunda dimensión: tamaño: La tira se gira 90° y se corre en SDS-PAGE.

El resultado es una mancha por proteína en un mapa de pI × peso. Para identificar una mancha hay que secuenciar la proteína y ahí entra la espectrometría de masas.

MALDI-TOF

Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization — Time of Flight: la proteína se cristaliza en una matriz que absorbe el láser y desorbe/ioniza la molécula sin fragmentarla. Luego, en el tubo de vuelo, el tiempo de vuelo depende de la masa: las moléculas ligeras llegan primero al detector. El resultado es un espectro de masas, es decir, una huella de la proteína.

• Modo lineal: Medición directa, rápida.
• Modo reflector: Un tubo adicional (el reflector) alarga la trayectoria y aumenta la resolución, es decir, separa mejor moléculas de masas muy similares.

Aplicación estrella: Identificación de bacterias y hongos por MALDI-TOF, el espectro ribosomal de una colonia se compara contra una base de datos y la identificación tarda minutos en lugar de días. También se usa en la detección molecular de patógenos en alimentos (ETA: intoxicaciones por plaguicidas y metales, toxi-infecciones por enterotoxinas de C. perfringens o S. aureus, e infecciones por virus, bacterias y parásitos).

iTRAQ: Cuantificar con etiquetas isobáricas

Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification: Etiquetas químicas que tienen la misma masa total (isobáricas) pero se fragmentan en iones reporteros distintos. Se marca cada condición (control, tratado, tiempo 1, tiempo 2…), se mezclan todas y se analizan juntas en el espectrómetro: como las etiquetas pesan igual, las proteínas idénticas de todas las condiciones co-eluyen; al fragmentar, cada etiqueta libera su ion reportero y la intensidad relativa de los iones da la abundancia de la proteína en cada condición. Cuantificación multiplexada en una sola corrida.

Del laboratorio a la clínica

• Identificación microbiana de rutina: Los hospitales identifican bacterias y hongos por MALDI-TOF como prueba estándar, una colonia del placa, espectro, base de datos, identificación en minutos. Cambió la práctica de la microbiología clínica.
• Marcadores tumorales: El Western sigue siendo la confirmación clásica de expresión de proteínas diana (HER2, receptores hormonales) que deciden terapia.
• Proteómica de plasma: Con iTRAQ/TMT y fraccionamiento previo se buscan biomarcadores en sangre, el reto es el rango dinámico: unas pocas proteínas abundantes dominan la muestra y las interesantes están mil veces más diluidas.
• Interactomas: Métodos de doble híbrido y co-inmunoprecipitación mapean quién se une a quién la capa funcional que el transcriptoma no muestra.

Puntos clave

• Sin PCR para proteínas, todo el campo se apoya en separación + detección específica.
• SDS-PAGE iguala la carga (SDS) y rompe disulfuros (2-mercaptoetanol): el gel ordena por peso, no por carga, esto es, al revés de la electroforesis de DNA, donde la carga ya era uniforme.
• 2D-PAGE separa por dos propiedades independientes (pI y peso): Una mancha = una proteína.
• MALDI-TOF convierte masa en tiempo de vuelo; el reflector compra resolución con trayectoria.
• iTRAQ hace que condiciones distintas se vean juntas pero se cuenten por separado.

Calcula tus geles de proteínas con la calculadora de SDS-PAGE — la separación por peso es la misma lógica del Western.