Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

El aislamiento de ácidos nucleicos es el primer paso de casi todas las metodologías de la biología molecular: no hay PCR, clonación, secuenciación ni hibridación sin un molde limpio. La estrategia concreta depende del objetivo posterior, no es lo mismo DNA para un chequeo por PCR que DNA de alta integridad para secuenciar un genoma o hacer un Southern, pero casi todo flujo de trabajo comparte la misma columna vertebral.

Un poco de historia

El DNA se aisló antes de saber que era el material genético. En 1869, Friedrich Miescher, buscando la composición química de los glóbulos blancos (a partir de apósitos usados, por falta de muestras frescas), obtuvo un precipitado rico en fósforo que llamó “nucleína”, el primer aislamiento de DNA de la historia. La reacción de sus contemporáneos fue fría: se asumía que las proteínas, con sus 20 aminoácidos, debían portar la herencia; un polímero de solo 4 unidades parecía demasiado simple. Tuvieron que pasar 75 años y el experimento de Avery, MacLeod y McCarty (1944), demostrar que el DNA era la “sustancia transformante” que convertía neumococos avirulentos en virulentos para que el aislamiento de Miescher se convirtiera en el fundamento de toda la biología molecular.

Los cuatro pasos universales

Toda extracción, desde un miniprep de 90 minutos hasta una extracción de genoma completo, recorre cuatro etapas:

1. Cultivo y cosecha del material: Crecer las células (o preparar el tejido) y concentrarlas por centrifugación, descartando el sobrenadante.
2. Lisis celular: Romper pared y membrana para liberar la cromatina (complejos DNA–proteína).
3. Purificación: Desnaturalizar las proteínas asociadas y separar el ácido nucleico de todo lo demás.
4. Concentración y recuperación: Precipitar el DNA en alcohol, lavar y redisolver.

La lisis: abrir la célula

La lisis puede ser biológica (enzimas como la lisozima, que hidroliza el peptidoglicano de la pared bacteriana), física (choque térmico, sonicación, perlas de vidrio) o química (agentes ácidos o alcalinos, detergentes). En la práctica se combinan: la lisozima abre la pared, el detergente disuelve la membrana.

Purificación: separar el DNA de todo lo demás

Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico (25:24:1)

El fenol desnaturaliza las proteínas (que quedan en la interfase o en la fase orgánica); el cloroformo extrae el fenol residual y ayuda a separar las fases; el alcohol isoamílico reduce la espuma y facilita la interfase. El pH del fenol decide qué queda en la fase acuosa:

• Fenol ácido (pH 5–6): El DNA queda protonado y migra a la interfase; el RNA permanece en la fase acuosa. Es la base de las extracciones de RNA.
• Fenol neutro (pH 7–8): Tanto DNA como RNA permanecen en la fase acuosa, es la configuración para extraer DNA.

CTAB

El bromuro de cetiltrimetilamonio es un surfactante catiónico que forma complejos insolubles con los ácidos nucleicos en presencia de sal alta. Es el método de elección para micobacterias (pared cerosa de ácidos micólicos) y plantas ricas en polisacáridos, que interfieren con los métodos clásicos.

Columnas de sílice y Perlas magnéticas

Las columnas de sílice adsorben el DNA en presencia de sales caotrópicas (que desordenan las capas de hidratación del sílice y de las proteínas); el DNA se eluye después con agua o buffer de baja fuerza iónica. Las perlas magnéticas funcionan con el mismo principio de unión, pero la “centrifugación” se reemplaza por un imán. Es la base de los minipreps automatizables en platos de 96 muestras.

Intercambio iónico y Gradiente de CsCl

Dos estrategias cromatográficas más: Los intercambiadores aniónicos (resinas tipo DEAE o QAE) retienen el DNA, un polianión, y lo eluyen aumentando la fuerza iónica del medio. El gradiente de CsCl separa por densidad: es el método clásico para purificar plásmido superenrollado con bromuro de etidio (el DNA lineal y el superenrollado bandean en posiciones distintas).

Precipitación y Concentración

El DNA precipitado necesita dos cosas: alcohol frío y sal.

El lavado final con etanol al 70% elimina las sales sin redisolver el DNA, y el botón se seca al aire antes de redisolver en TE o agua.

Cuantificación y Calidad por absorbancia

La cuantificación por espectrofotometría usa la ley de Beer-Lambert:

$$A = C \cdot \varepsilon \cdot b \quad \rightarrow \quad [\text{DNA}] = A_{260} \times 50 \, \mu\text{g/mL} \times \text{FD}$$

donde FD es el factor de dilución. Para DNA de doble cadena, una absorbancia de 1.0 a 260 nm equivale a 50 µg/mL.

Ejemplo resuelto: Se mide A₂₆₀ = 0.650 en una dilución 1:50 del extracto.

$$C = 0.650 \times 50 \, \mu\text{g/mL} \times 50 = 1625 \, \mu\text{g/mL (en el tubo original)}$$

La pureza se evalúa con los cocientes:

• 260/280 — esperado ~1.8 para DNA limpio. Menor → contaminación de proteínas o fenol. Mayor → RNA contaminante.
• 260/230 — esperado 2.0–2.2. Menor → sales, guanidina o fenol residuales.

El caso plasmídico: lisis alcalina controlada

Separar DNA plasmídico del genómico explota una diferencia de conformación, no de tamaño. El plásmido es circular superenrollado; el cromosoma está anclado a la membrana.

1. En pH 12–12.5 (NaOH) se desnaturaliza todo el DNA: Las cadenas se separan.
2. Al neutralizar con acetato de potasio (CH₃COOK), el plásmido que sigue entrelazado por su superenrollamiento se renaturaliza correctamente y permanece soluble.
3. El DNA genómico, enorme y unido a membrana, no puede renaturalizar de forma ordenada: precipita junto con el SDS-proteína y se elimina por centrifugación.

El sobrenadante contiene el plásmido, que se recupera por fenol-cloroformo y precipitación, o directamente en columna de sílice por intercambio iónico.

Otros métodos que conviene reconocer

• PEG (polietilenglicol): En extracción de DNA fágico: en presencia de NaCl absorbe agua del medio y hace que los fagos de grandes volúmenes de cultivo formen agregados macromoleculares separables por centrifugación, concentrándolos antes de extraer.
• 2-β-mercaptoetanol: Reduce puentes disulfuro; complementa al SDS cuando las proteínas a eliminar son ricas en cisteína.
• Cloruro de guanidinio 6 M: Agente caotrópico que desestabiliza interacciones no covalentes; combinado con ciclos de congelación–descongelación lisia eficientemente células de envoltura compleja (e.g. micobacterias, vegetales).

Del laboratorio a la clínica

Los principios de esta ficha sostienen hoy aplicaciones que Miescher no habría imaginado:

• Biopsia líquida: El DNA libre de células (cfDNA) circula en sangre en fragmentos diminutos (~160 pb, el “pequeñeo” del nucleosoma). Extraerlo y secuenciarlo permite detectar mutaciones tumorales o DNA fetal sin biopsia de tejido, una extracción donde el rendimiento es tan bajo que cada paso de esta ficha se optimiza al límite.
• Automatización total: Los robots de extracción con perlas magnéticas procesan 96 muestras en paralelo con el mismo esquema lisis → unión → lavados → elución; los laboratorios de diagnóstico corren cientos de PCR diarias sobre ese DNA.
• Muestras forenses y antiguas: De un hueso de hace milenios o una huella biológica se extraen cantidades ínfimas y muy fragmentadas. La extracción es el cuello de botella que decide si el experimento existe o no.

Puntos clave

• La estrategia de extracción la dicta el uso posterior y el material biológico.
• El pH del fenol decide si recuperas DNA o RNA, es química ácido-base, no magia.
• Alcohol frío + sal = Precipitación; el lavado 70% elimina sales.
• 260/280 ≈ 1.8 y 260/230 ≈ 2.0–2.2 son los valores de referencia de un extracto limpio.
• La lisis alcalina separa plásmido de genoma por conformación, no por tamaño.