Clonación en E. coli de un DNA Recombinante
Preparación de células competentes con CaCl2, ligación con tres ratios vector:inserto, transformación y selección azul/blanco.
Material biológico
- E. coli DH5α (o similar) para hacer competentes
- Plásmido pCRII digerido con EcoRI-BamHI
- DNA del gen idsA2 amplificado por PCR y purificado
- pCRII + inserto conocido (T+) y pCRII sin inserto (T−)
De la molécula recombinante a las colonias blancas: preparación de células competentes, ligación, transformación y selección. El diseño de la ligación titra el ratio vector:inserto.
I. Células competentes por sales de CaCl₂
- Sembrar la cepa de E. coli a transformar en 3 mL de LB e incubar toda la noche a 37 °C.
- Al día siguiente, inocular 100 mL de LB con 3 mL del preinóculo y cultivar a 37 °C con agitación hasta A600 = 0.25–0.4 (~1.5 h): fase logarítmica temprana, cuando la membrana es más permeable.
- Transferir a 2 tubos de centrífuga estériles y enfriar en hielo 5 min.
- Centrifugar a 2,800 × g durante 10 min a 4 °C.
- Decantar y resuspender con cuidado cada tubo en 2 mL de CaCl₂ 0.1 M estéril y frío. Mantener en hielo 10 min.
- Repetir los pasos 4–5, dejando las células en hielo 30–60 min.
- Repetir una vez más, resuspendiendo en 1 mL de CaCl₂ 0.1 M, y preparar alícuotas de 200 µL en microtubos estériles.
- Dejar en hielo 1–8 h. Para conservar días: Añadir glicerol estéril (concentración final 15%) y almacenar a −70 °C.
II. Ligación
Prepara la mezcla de 10 µL finales:
| Reactivo (µL) | Volúmenes por añadir |
|---|---|
| Agua estéril | 4.0 |
| Regulador de ligasa 10X | 1.0 |
| Plásmido digerido | 1.0 |
| Gen ζ / idsA2 purificado | 3.0 |
| Ligasa (1 U/µL) | 1.0 |
Incubar a 15 °C durante toda la noche (la ligasa trabaja mejor a baja temperatura, donde los extremos anilinean más tiempo antes de sellarse).
III. Transformación
- Hielo 30–60 min.
- Choque térmico: Exactamente 90 s a 42 °C — más tiempo inactiva las células competentes.
- De vuelta al hielo 2 min inmediatamente.
- Añadir 400 µL de LB a cada tubo e incubar 60 min a 37 °C: Expresión de las resistencias antes de la selección.
- Sembrar por duplicado, con varilla acodada: 50 µL de los tubos testigo y 250 µL del tubo problema, en placas de LB + ampicilina + X-Gal. Incubar 37 °C, 18–20 h.
- Contar las colonias. Colonias azules = Vector sin inserto (LacZα intacto hidroliza el X-Gal); colonias blancas = Recombinantes.
- Picar las colonias blancas con palillo estéril e inocular tubos de LB + ampicilina (50 µg/mL).
- Purificar el plásmido de una colonia por miniprep (ver protocolo) y confirmar el inserto digestionando con EcoRI según el protocolo de restricción enzimática.
Eficiencia de ligación
Función de cada reactivo
CaCl₂ 0.1 M frío
Hace competentes las células: los iones divalentes estabilizan la membrana y facilitan la toma de DNA desnudo.
Desbalance: Sin cadena de frío estricta, la eficiencia de transformación se desploma.
T4 DNA Ligasa (1 U/µL)
Forma los enlaces fosfodiéster entre inserto y vector, consumiendo ATP. Va al final y en frío.
Desbalance: Exceso → ligación de vectores entre sí. Defecto → extremos abiertos.
X-Gal + IPTG (50 µg/mL en placa)
Sustrato cromogénico e inductor de la β-galactosidasa: la α-complementación de lacZα produce colonias azules. El inserto interrumpe lacZα → colonias blancas.
Ampicilina (50 µg/mL final)
Selección: solo crecen bacterias transformadas con el vector (gen bla).
Glicerol 15%
Crioprotector para almacenar células competentes a −70 °C sin que el congelamiento las lise.