Reactivos y enzimas: qué atacan o estabilizan, stock vs. trabajo, y qué falla cuando la concentración falla.
Este catálogo detalla la función de los reactivos clave usados en biología molecular, basados en protocolos estándar.
Lisis celular
Reactivo
Función
Lisozima
Enzima que rompe las paredes celulares bacterianas (cataliza la hidrólisis de las uniones β-1,4 entre los residuos del ácido N-acetilmurámico y la N-acetil-D-glucosamina).
Ácido etilén diamino tetra acético (EDTA)
Agente quelante de cationes divalentes; desestabiliza la membrana celular e inhibe la acción de las DNAsas al capturar su cofactor Mg²⁺.
Glucosa
Regula la presión osmótica durante la obtención de esferoplastos.
Dodecil sulfato de sodio (SDS)
Detergente aniónico que solubiliza lípidos de membrana.
Cloruro de Guanidinio 6M
Agente caotrópico que desnaturaliza y disuelve macromoléculas (proteínas) mediante la desestabilización de interacciones no covalentes. Utilizado junto con ciclos de congelación-descongelación, permite una lisis más eficiente de células con envoltura celular compleja.
2-β Mercaptoetanol
Desnaturaliza proteínas mediante la reducción de puentes disulfuro.
Tween 80 y Triton X-100
Detergentes no iónicos que disuelven membranas. Utilizados durante la obtención de DNA plasmídico para causar menor contaminación con DNA genómico, ya que los iónicos como el SDS pueden producir fragmentación del DNA genómico.
Desnaturalización de proteínas asociadas al DNA
Reactivo
Función
Proteinasa K
Proteasa de amplio espectro (actúa a pH alcalino e incluso en presencia de detergentes como el SDS).
Fenol
Desnaturaliza proteínas y favorece la extracción de lípidos.
Cloroformo – Alcohol isoamílico
Remueve el fenol residual de la fase acuosa y algunas proteínas previamente precipitadas por el fenol.
Purificación y Precipitación
Método / Reactivo
Principio / Función
Intercambio iónico (DEAE, QAE)
Separación por cromatografía: elución mediante cambios en la fuerza iónica (sales).
Partículas de sílice
Adsorción: el DNA se une a la sílice en presencia de sales de guanidinio.
Gradiente de CsCl
Separación del DNA mediante gradiente de densidad.
Etanol o Isopropanol
Disminuyen la constante dieléctrica del medio favoreciendo la precipitación del DNA disuelto en un medio acuoso.
Otros métodos de extracción
Método
Utilidad
CTAB
Ideal para aislar DNA de células con altas proteínas y carbohidratos (plantas, micobacterias, hongos). El CTAB se une a los ácidos nucleicos formando complejos que se disocian luego con NaCl 1M.
Lisis alcalina - SDS
Eficiente para extracción de DNA plasmídico. NaOH a pH 12 + SDS lisan y desnaturalizan. Al neutralizar con acetato de potasio, el SDS y DNA genómico precipitan pero el plasmídico (circular) se renaturaliza y queda en solución.
PEG (Polietilenglicol)
Para concentrar fagos en volúmenes grandes. En presencia de NaCl absorbe agua y genera agregados que precipitan por centrifugación.
Amplificación (PCR)
Reactivo
Función e Importancia
Taq Polimerasa (y similares)
Polimerasa termoestable (óptima a 72 °C). Extiende los primers de 5' a 3'. Fallo por falta de proofreading (en Taq clásica) o inactivación térmica si se somete a >95 °C prolongados.
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Ladrillos para la síntesis de nuevo DNA. Desbalance: mutaciones o inhibición enzimática (compiten por el Mg²⁺). Concentración típica de trabajo: 200 µM cada uno.
Cloruro de Magnesio (MgCl₂)
Cofactor esencial de la polimerasa. Exceso: bandas inespecíficas (reduce la astringencia). Defecto: baja o nula amplificación. Rango típico: 1.5 a 2.5 mM.
Buffer de PCR (Tampón)
Mantiene el pH y la fuerza iónica (KCl) idóneos. Puede contener estabilizadores como albúmina sérica bovina (BSA) o detergentes (Triton X-100).
Clonación y Transformación
Reactivo
Función e Importancia
T4 DNA Ligasa
Forma enlaces fosfodiéster entre los extremos 5'-fosfato y 3'-OH de DNA bicatenario (vector e inserto). Requiere ATP como cofactor. Actúa mejor a baja temperatura (4 - 16 °C) para estabilizar el alineamiento.
Cloruro de Calcio (CaCl₂)
Neutraliza las cargas negativas de los fosfatos de membrana celular bacteriana y del plásmido, facilitando la adhesión (competencia química). El choque térmico a 42 °C abre los poros transitoriamente.
Sustrato cromogénico. Si es hidrolizado por la β-galactosidasa (gen lacZ intacto sin inserto), genera un compuesto azul intenso (selección blanco/azul).
IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido)
Inductor no metabolizable del operón lac. Desbloquea la transcripción de lacZ para permitir la prueba de selección azul/blanca.
Antibiótico (ej. Ampicilina)
Ejerce la presión de selección positiva: solo las bacterias transformadas (que adquirieron el gen de resistencia presente en el vector) logran sobrevivir y formar colonia.